以重组腺相关病毒（rAAV）载体为代表的基因疗法为根治遗传性疾病带来了希望。开发 rAAV 药物产品的检测组合以可靠地评估其效力、纯度和特性对于加速向患者群体提供这些疗法至关重要。rAAV 制造中使用的质粒起始材料或 rAAV 载体内包裹的遗传物质的精确序列同一性测试可以通过多方面测序方法来完成。

从历史上看，DNA 测序的黄金标准是链终止测序（也称为Sanger测序）。虽然该方法可以以合理的精度对中等长度 (<1 Kb) DNA 片段进行测序，但它需要先验了解目标才能对异质群体进行测序。适应基因治疗产品使用的测序方法需要替代方法，以允许对病毒载体和质粒 DNA 进行全面和高质量的表征，同时保持高通量。

近来，Forge 开发了一种先进的混合测序方法，用于综合分析 rAAV 载体和质粒DNA，克服了典型的平台限制，例如由于高GC含量或低复杂性序列导致的覆盖范围差距。将测序数据解释为原材料和基因治疗产品的质量衡量标准需要专门的分析。Forge 的内部分析团队为每个基因治疗产品提供多步骤生物信息学分析，确保测序读数以高度置信度正确分配到其源基因组或序列。所开发的方法可实现高效的测序和分析，与传统的外包测序检测相比，获得结果的时间缩短了 75%。

过去十年测序方法的进步使得基因组表征在细胞和基因疗法开发、制造和产品发布测试中得到应用。具体来说，序列同一性测试现在经常作为 rAAV 载体和用作基因治疗制造原材料的高质量质粒 DNA 表征测试的一部分进行。

在表征 rAAV载体和质粒DNA时，短读长和长读长测序方法都具有独特的优点和局限性。短读长测序，也称为下一代测序 (NGS)，涉及读取短 DNA 片段，长度通常约为 100-600 个碱基对。该方法以其高精度、高覆盖深度、低错误率以及相对较低的每个碱基成本而闻名。因此，短读长测序适用于识别 rAAV 或质粒基因组中的单核苷酸变异和小插入或缺失。这种测序方法的高覆盖深度也使其有助于检测 AAV 或质粒群体中的低频变异。然而，短读长测序的主要限制之一是难以解析重复区域，例如反向末端重复序列（ITR）和短读长导致的复杂结构变异。

另一方面，长读长测序，也称为第三代测序，可以对单个 DNA 分子进行测序，长度通常为数千到数万个碱基对。这些现代平台可以克服其他测序方法中存在的局限性，例如短读长、读数错误或在片段化、扩增或样品制备的实验室工作过程中引入的伪影。长读长测序有利于解析复杂的基因组区域，包括重复序列或结构变异。它可以促进全长 rAAV 基因组的读出，包括 ITR 和侧翼序列。然而，与短读长测序相比，长读长测序方法可能具有更高的错误率，并且每个碱基的成本也相对更高。

基因治疗开发商和制造商通常会根据要测序的材料（例如，质粒 DNA 与 rAAV）权衡准确性、成本、读长、待测序基因组区域的复杂性等因素，在两种测序方法之间进行选择 ）。

采用基于测序的方法进行 rAAV 载体表征可以在工艺开发以及临床和商业制造过程中提供有价值的见解。完整而准确的测序可以增强载体设计，发现以前隐藏的包装挑战，并提供关键的质量和安全数据作为 rAAV 发布测试的一部分。

Forge 的优化混合短读长和长读长 DNA 测序方法利用每个平台的优势，为基因治疗产品提供全面且高度准确的测序数据（图 1A）。利用短读长和长读长测序可对测序数据进行正交验证，从而实现整个基因组的一致覆盖，即使在具有挑战性的区域也是如此（图 1B）。虽然短读长可以捕获遗传变异区域，但长读长测序可以检测复杂的结构变异，例如倒位、重复、缺失或易位。此外，短读长测序在全面表征 rAAV 基因组的能力方面受到限制，而基因治疗产品的身份是一个关键的质量属性。相反，长读长测序可以对完整、部分和空 rAAV 基因组进行定量和定性表征（图 1C）。事实上，空衣壳总是含有一些基因组内容，长读长测序揭示了之前被认为是空衣壳的东西含有带有 ITR 的短 DNA 片段。

图 1. 用于 rAAV 表征的创新混合短读长和长读长测序方法。

A) Forge Biologics 的 rAAV 测序混合短读长方法的示意图。B) rAAV 产品的测序覆盖率的图形表示。顶部轨道对应于载体的GC内容，而底部四个轨道代表载体的三种短读长测序方法和长读长测序。C) rAAV 产品的“部分”条带和“完整”条带之间差异的可视化，其中部分条带表现出高比例的短 ITR 相邻片段。

除了确认 rAAV 载体的基因组序列同一性外，混合短读长和长读长测序方法还可以筛选非目标序列（与过程相关的杂质），例如残留的质粒 DNA 和残留的哺乳动物宿主细胞 DNA（图 2A 和2B）。rAAV载体的序列分析可以进一步确保产品中不存在致癌元件序列（例如E1A/E1B、SV-40大肿瘤抗原等）（图2B）。Forge 的混合测序方法具有高灵敏度，能够检测最终产品中低至 0.01% 的残留污染物（如掺入实验所示，图 2C）。

图 2. 使用基于测序的方法分析 rAAV 产品中的杂质。

A) rAAV 样本中与 rAAV 载体基因组（红色）、残留质粒（橙色）或其他杂质（蓝色）对齐的读数的数量和长度。B) rAAV 产品批次的基因组组成的表示，量化样品中载体基因组和残留杂质的百分比。C) 使用主质粒和一组六个“污染物”载体进行的掺入实验，显示检测率低至 < 0.01%。

通过长读长测序深入表征质粒 DNA

高质量 rAAV 的生产始于在上游 AAV 制造过程中利用高质量质粒DNA 进行三重转染。确保序列同一性是质粒DNA表征和质量控制的一个关键方面。ITR 的高 GC 含量和回文性质使得目的基因 (GOI) 质粒在质粒生产过程中容易在这些区域发生突变。ITR 区域的突变会影响 rAAV 的生产 [3]。因此，在用于上游 AAV 制造之前，必须确认 GOI 质粒中 ITR 区域的序列。

Forge Biologics 采用基于长读长测序的分析流程来快速表征使用 Forge 质粒制造服务生产的 GMP 途径和 GMP 级质粒（图 3A）。

将基于测序的分析纳入质粒制造工作流程的多个步骤中，确保只有高质量和高纯度的材料才能用于下游应用（例如，rAAV 制造）。制造含有 ITR 的质粒的一个特殊挑战是自发产生含有截短 ITR 的细菌亚群的可能性（图 3B）。从细菌主细胞库的最初一代开始，长读长测序检查点可确保均匀覆盖，并在整个培养和质粒生产过程中监测 ITR 完整性和稳定性，能够检测是否存在任何含有截短 ITR 的亚群（图 3C- D）。

图 3. 高质量 DNA 的长读长测序可确保细菌细胞库中不存在亚群。

A) 质粒 DNA 制备和测序工作流程示意图。B) 含有截短 ITR 的细菌亚群自发生成的图示。GOI 质粒在转化为细菌宿主（例如大肠杆菌）后的初始时间点 (T1) 包含完整的 ITR 区域（蓝色）。随着细菌传代 (T2-T3)，亚群可能会发生自发突变，导致 GOI 质粒中的 ITR 区域（红色）被截短。携带截短 ITR 的细菌群体比例可能会随着传代的增加而增加 (T4)。C) 四个时间点的质粒的视觉表示。可以观察到截短的亚群随着时间点的推进而增长，图形表示显示整个质粒基因组的覆盖范围、观察到的截短百分比，并且读取长度的直方图显示出现的第二峰，对应于截短的（较短的）亚群。D) 质粒基因组覆盖率的图形表示，显示大部分基因组的均匀覆盖率，其中 5' ITR 序列有明显的缺失。

先进的质粒和 rAAV 基因治疗产品混合测序方法

目前可用的测序解决方案需要大量的开发和优化才能与基因治疗产品兼容。然而，质粒起始材料和 rAAV 产品的正确测序对于维持产品质量和安全至关重要。Forge 的混合短读长和长读长测序方法可实现适应性强、可靠且全面的产品表征，包括高灵敏度检测残留杂质（图 4）。Forge 的混合短读长和长读长基因组测序工作流程提供的正交验证本质上增强了人们对基因治疗产品的安全性和质量的信心。

图 4. 质粒和 rAAV 基因治疗产品基于测序的方法概述

参考文献

1. Tai PWL, Xie J, Fong K, Seetin M, Heiner C, Su Q, Weiand M, Wilmot D, Zapp ML, Gao G. Adeno-associated Virus Genome Population Sequencing Achieves Full Vector Genome Resolution and Reveals Human-Vector Chimeras. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Feb 13;9:130-141. doi: 10.1016/j.omtm.2018.02.002. PMID: 29766023; PMCID: PMC5948225.

2. Namkung S, Tran NT, Manokaran S, He R, Su Q, Xie J, Gao G, Tai PWL. Direct ITR-to-ITR Nanopore Sequencing of AAV Vector Genomes. Hum Gene Ther. 2022 Nov;33(21-22):1187-1196. doi: 10.1089/hum.2022.143. PMID: 36178359; PMCID: PMC9700346.

3. Assad W, Volos P, Maksimov D, Khavina E, Deviatkin A, Mityaeva O, Volchkov P. AAV genome modification for efficient AAV production. Heliyon. 2023 Apr 1;9(4):e15071. doi: 10.1016/j.heliyon.2023.e15071. PMID: 37095911; PMCID: PMC10121408.